CARA PENELITIAN TENTANG KANKER

a. Bahan

1.  Sintesis GVT-0, PGV-0, dan HGV-0 

Aseton, siklopentanon, sikloheksanon, tributilborat, vanilin (p.s. E.Merck); asam asetat glasial, asam klorida, etanol, etil asetat, heksan, kloroform,  metanol (p.a. Merck, Germany), dan  akuades.

2.  Uji Antikanker in vivo

Alkohol 70%, analog kurkumin (GVT-0, PGV-0, dan HGV-0) yang disintesis sesuai  prosedur (Sardjiman, 2000), akuades, 1,2-dimetilhidrazin.2HCl (ABCR, Germany), formalin 10%, kurkumin (Merck, Germany), tikus jantan galur Wistar dengan bobot badan 150 – 200 g dan umur 2 bulan, dan  phosphate buffered-saline (PBS)

b.  Alat

1.  Sintesis, identifikasi, dan uji hasil sintesis 

Alat pemeriksaan titik lebur (Buchi Melting Point B-540), beker gelas, bunsen, cawan porselin, corong Buchner, Erlenmeyer, kertas saring (Whatman 40), labu hisap, lempeng kromatografi lapis tipis (KLT) dengan fase diam GF₂₅₄, pipet ukur, spektrofotometer UV-Vis (Shimadzu A1601), spektrofotometer IR (Perkin Elmer Spectrum 100), spektrometer massa (Mariner Mass Spectrometer), spektrometer  resonansi magnet inti (Varian XL-400), termopan (Reichert Austria; Nr. 340579), timbangan elektrik (Sartorius).

2.  Uji Kemoprevensi in vivo

Alat suntik, eppendorf, kandang hewan, kannula, timbangan hewan

c.  Jalannya Penelitian

Tahapan penelitian yang akan dikerjakan adalah : (1) Sintesis GVT-0, PGV-0, dan HGV-0; (2) Uji kemurnian dan identifikasi hasil sintesis kurkumin, GVT-0, PGV-0, dan  HGV-0 dengan elusidasi struktur; (3) Pengujian kemoprevensi in vivo  hasil sintesis GVT-0,  PGV-0, dan  HGV-0 dengan model kanker kolorektal pada tikus.

1.  Sintesis GVT-0, PGV-0 dan HGV-0 (Sardjiman, 2000)

1.1.  Sintesis GVT-0

Vanilin (38,5 g;0,25 mol), (27,75 ml;0,38 mol) aseton, 3,5 ml HCl pekat.  Aduk pada suhu -10^oC (dalam lemari pendingin) selama 1 jam, kemudian pada suhu kamar selama 2 jam.  Setelah didiamkan selama 8 hari (warna menjadi coklat), campuran tersebut dicuci dengan air:etanol (1:0,57) sampai terbentuk warna jingga.  Campuran dicuci dengan air dingin sampai bebas asam lalu dikeringkan.

1.2.  Sintesis PGV-0

Vanilin (15,4 g; 0,1 mol) dalam Erlenmeyer ditambah siklopentanon (4,4 ml; 0,05 mol) diaduk sampai homogen pada suhu 25 – 30 ^oC. Ditambahkan 2,0 ml HCl pekat bertetes-tetes, kemudian pengadukan dilanjutkan selama 1 jam (sampai memadat).  Hasil didiamkan selama 2 hari pada suhu kamar, kemudian diisolasi dengan maserasi campuran  asam asetat glasial – air (1:1), kemudian disaring dengan cepat dalam keadaan dingin dan dilanjutkan dengan campuran asam asetat glasial – air sampai warna hijau tua hilang.  Dicuci dengan air panas sampai bebas asam dan dikeringkan.

1.3.  Sintesis HGV-0 

Vanilin (15,4 g; 0,1 mol) dalam Erlenmeyer ditambah sikloheksanon (4,4 ml; 0,05 mol) diaduk sampai homogen pada suhu 25 – 30 ^oC. Ditambahkan 2,0 ml HCl pekat bertetes-tetes, kemudian pengadukan dilanjutkan selama 1 jam (sampai memadat).  Hasil didiamkan selama 2 hari pada suhu kamar, kemudian diisolasi dengan maserasi campuran  asam asetat glasial – air (1:1), kemudian disaring dengan cepat dalam keadaan dingin dan dilanjutkan dengan campuran asam asetat glasial – air sampai warna hitam kemerahan hilang.  Dicuci dengan air panas sampai bebas asam dan dikeringkan.

2. Uji kemurnian dan identifikasi hasil sintesis GVT-0, PGV-0, dan HGV-0

2.1.  Pengujian kemurnian dengan penentuan jarak lebur

Senyawa hasil sintesis dan hasil pemurnian diuji jarak leburnya dengan alat Buchi Melting Point B-540. 

2.2.  Pengujian kemurnian dengan Kromatografi Lapis Tipis (KLT)

Senyawa dilarutkan dalam metanol, kemudian ditotolkan sebanyak 2 ml pada lempeng silica gel GF₂₅₄ dari aluminium, dengan fase gerak campuran heksan, kloroform, etil asetat, dan metanol dengan perbandingan bervariasi untuk menghasilkan pemisahan yang sempurna.  Spot kromatogram diamati pada UV 254 dan 366 nm.

2.3.  Elusidasi Struktur

Elusidasi struktur dilakukan menggunakan spektrofotometer UV-VIS, spektrofotometer inframerah, spektroskopi massa, dan spektrometer NMR yang analisis hasilnya digunakan untuk menginterpretasikan rumus struktur dari senyawa hasil sintesis.

3.  Uji kemoprevensi kolorektal

3.1.  Penimbangan Bobot Badan pada Hewan Coba

            Tikus Wistar ditimbang 1 kali dalam seminggu dan dilakukan selama 2 minggu pada tahap adaptasi hewan.  Selanjutnya penimbangan berat  badan hewan coba dilakukan sehari sebelum dilakukan induksi untuk menghitung jumlah dosis yang akan digunakan.  Keesokan harinya, hewan coba ditimbang lagi lalu diinduksi.

3.2. Induksi Kanker Kolorektal

Tikus Wistar yang telah diadaptasikan selama 1 minggu, bobot badannya ditimbang sehari sebelum induksi dengan 1,2-dimetilhidrazin.2HCl sebanyak 1 ml.  Penginduksian dilakukan sebanyak 1 kali seminggu secara injeksi subkutan (s.c) selama 15 minggu.  Setelah diinduksi selama 15 minggu, tikus dibiarkan selama 10 minggu lalu dibedah dan diamati kanker yang terjadi (Ravnik-Glavac et al., 2000).

3.3.  Pengamatan Morfologi

Saat otopsi, semua organ dalam diperiksa kecuali sistem saraf pusat.  Perhatian khusus kemungkinan adanya tumor pada saluran pendengaran bagian luar.  Bagian perut dibuka melalui lengkungan utama sedangkan usus secara longitudinal pada sisi antimesenterial; setelah dibuka, organ-organ tersebut dicuci dengan air.  Bagian akhir ileum, usus besar, anus dan neoplasma dalam usus kecil disebar di atas papan polystirene dengan mukosa usus menghadap ke atas.  Semua jaringan disimpan dalam buffer formalin 10%.  Seluruh lesi pada usus dinilai berdasarkan kriteria makroskopik dan histologis yang digunakan pada patologi manusia (Ravnik-Glavac et al., 2000). 

3.4.  Pewarnaan untuk Ekspresi Protein p53, K-ras, APC, dan COX-2

Empat mm bagian blok parafin dipotong.   Bagian yang tidak berparafin, diteteskan larutan H₂O₂ 3% dalam metanol untuk memblokir aktivitas peroksidase endogen.  Teteskan antibodi monoklonal primer untuk protein yang ingin diamati, diinkubasi selama 30 menit pada suhu kamar.  Kompleks antigen-antibodi divisualisasikan menggunakan teknik pewarnaan biotin-streptavidinperoksidase.  Warna dikembangkan dengan larutan diaminobenzidin (DAB) dan ditambahkan hematoxylin.  Slide kemudian dikeringkan dan diamati di bawah mikroskop (Ghavam-Nasiri et al., 2007).

3.5.  Perlakuan dengan  Senyawa Kurkumin dan Analognya

Tikus Wistar (130 ekor) dibagi dalam 5 kelompok.  Kelompok 1 (kontrol positif) yang diberikan injeksi DMH.2HCl.  Kelompok 2, 3, 4, dan 5  dilakukan hal yang sama dengan kelompok 1 dengan pemberian senyawa kurkumin dan analognya (GVT-0, PGV-0, dan HGV-0) sebanyak 20, 40, 60 mg/kg  bobot badan yang dibuat suspensi dengan Na CMC 0,5% diberikan per oral dan dibuat segar setiap perlakuan.  Kelompok  5 (kontrol negatif) yang diinjeksi subkutan (s.c) dengan larutan fisiologis 1 ml.  Tikus pada kelompok 1 dan 5diberikan akuades secara per oral.  Bobot badan seluruh hewan ditimbang satu kali seminggu sampai akhir pemberian injeksi DMH, dan setiap  minggu sampai akhir perlakuan pada minggu ke-5.  Hewan dibedah pada minggu ke-25.  Kolon dikeluarkan dan dibuka secara longitudinal, dibersihkan dengan PBS, dimasukkan dalam formalin 10%, dikeringkan dan ditanam dalam parafin, bagian dengan ketebalan 5 mm diproses untuk analisis histopatologi.

Skema/alur kerja pada penelitian ini dapat dilihat pada gambar 10

d.  Analisis Data

·         Hasil penelitian in vivo meliputi jumlah nodul, area (diameter PxL) dianalisis secara non-parametrik.

·         Derajat kerusakan jaringan dianalisis secara deskriptif

·         Ekspresi protein yang berkaitan dengan progresi/pertumbuhan kanker kolorektal dianalisis dengan one way ANOVA diikuti dengan Poshoc Test (Tukey Test)

·         Berat badan analisisnya dengan multi factor random design (Split Splot)

Tweet

Jangan sampai ketinggalan postingan-postingan terbaik dari Ramalan Hari Ini | Horoskop | Shio. Berlangganan melalui email sekarang juga:

Atau sobat juga bisa follow Ramalan Hari Ini | Horoskop | Shio dengan mengklik tombol di bawah ini:

Artikel keren lainnya:

Ditulis oleh Unknown pada tanggal Kamis, 30 Mei 2013